烟雾病是一种独特的脑血管疾病，其特征在于双侧颈内动脉的进行性闭塞。内皮集落形成细胞，以前称为“内皮祖细胞”，在烟雾病的发病机制中起重要作用。在这项研究中，作者对烟雾病患者的内皮集落形成细胞s线粒体进行了形态学和功能研究，以期对该疾病的发病机制提出新的见解。在透射电子显微镜和共聚焦激光扫描显微镜下检查来自5个烟雾病患者和5个健康对照的内皮集落形成细胞的形态。测量氧消耗速率，线粒体膜电位，细胞内Ca2+浓度，线粒体酶活性和活性氧水平。使用毛细管形成测定评估内皮集落形成细胞的功能活性。来自烟雾病患者的内皮集落形成细胞显示出破坏的线粒体形态，包括更短和更圆形的形状。来自烟雾病患者的内皮集落形成细胞线粒体表现出功能异常，其被评估为测量氧消耗速率降低和细胞内Ca2+浓度增加。此外，来自烟雾病患者的内皮集落形成细胞显示活性氧水平增加。有趣的是，用活性氧清除剂治疗不仅逆转了线粒体异常，而且还恢复了烟雾病患者的内皮集落形成细胞s的血管生成活性。与健康患者相比，来自烟雾病患者的内皮集落形成细胞的线粒体表现出形态学和功能异常。这一发现表明线粒体异常可能在烟雾病的发病机制中起作用。
　　 烟雾病是原因不明的独特脑血管障碍，其特征在于，颈内动脉的渐进双边阻塞，并用在脑底动脉侧支血管及其主要分支。已确定该疾病在东亚的患病率较高，并且10％-15％的烟雾病患者具有该疾病的家族史。此外，众所周知，烟雾病在女性中更为频繁地发生。该信息表明遗传因素参与了烟雾病的病因学。
　　 因此，烟雾病的多种遗传分析试图揭示该疾病的潜在致病机制。例如，许多全基因组连锁研究已经确定了一些与烟雾病然而，独立研究未能确定烟雾病与这些基因座之间的关联,除了17q25基因座。最近的遗传学研究表明，17q25处的RNF213基因座是烟雾病的重要易感基因。然而，仍然缺乏关于该基因确切作用的数据，一份报告甚至表明该基因可能不仅仅是烟雾病的原因，而且可能存在烟雾病的其他易感基因。
　　 因此，需要关于烟雾病发病机理的新方法和多模式研究。在先前的报道中，内皮祖细胞或血管祖细胞显示在生理或病理性血管发生中起重要作用。大量证据表明，循环内皮祖细胞有助于多种心血管疾病的发展。特别地，已经证明循环内皮祖细胞的功能障碍或减少的数量与中风的发病机理有关。有趣的是，最近的研究表明循环内皮祖细胞和烟雾病的发展之间的紧密相关性。此外，还已经报道，在烟雾病患者循环内皮祖细胞功能失调;但是，对于功能障碍的原因尚不清楚。
　　 在这项研究中，研究人员调查了烟雾病患者中循环内皮细胞集落形成细胞功能障碍的原因，此前称为“内皮祖细胞s”。研究人员将内皮祖细胞称为内皮集落形成细胞，因为来自体外外周血细胞的贴壁培养物的生长细胞可能具有纯内皮祖细胞的不同特征。在本研究中，研究人员发现内皮集落形成细胞的线粒体异常与烟雾病患者中循环内皮集落形成细胞的功能障碍有关。
　　 如前所述，烟雾病在女性中更常发生。这女性优势是显著多在家族性病例比散发病例明显。在家庭病例中，女性/男性的比例显着增加到5.0。此外，据报道，在家族性烟雾病病例中，母亲传播/父亲传播的比例增加了3倍以上。研究人员根据这些报告，烟雾病显示特性继承设计本研究。本研究首次分析了烟雾病患者的内皮集落形成细胞s线粒体。根据研究人员的研究结果，研究人员对烟雾病的发病机制提出了新的见解。
　　 在获得患者和/或其父母的知情同意后，研究人员在血运重建手术期间从烟雾病患者获得血液样本。通过血管造影研究证实所有患者均患有烟雾病。本研究包括5名烟雾病患者的血液样本，患者年龄中位数为13岁。对照组招募了5名健康志愿者，他们的中位年龄为23岁。这些志愿者没有中风，高血压或吸烟史。烟雾病患者和对照组的临床特征总结。
　　 本研究经首尔国立大学医院机构审查委员会批准。所有参与者均签署了知情同意书盲人观察者不知道每位患者的临床信息，进行了一系列体外实验，以检查线粒体的超微结构和功能。用于培养的所有血液样品在收集后2小时内处理。用磷酸盐缓冲盐水以1：1稀释外周血，并从Ficoll的血沉棕黄层中分离单核细胞，并在磷酸盐缓冲盐水中洗涤3次。将细胞接种在涂有I型胶原的培养皿上，并在内皮细胞生长培养基中以每孔细胞的密度生长。将细胞在潮湿的气氛中保持在37℃。根据制造商的说明，使用试剂盒从内皮集落形成细胞获得DNA样品。在DNA提取和定量后，用合适的引物组对DNA样品进行PCR扩增。所述的测序分析一种变体在测序进行的，数据通过ABI测序分析软件进行分析。将正常和烟雾病内皮集落形成细胞在冷的2.5％戊二醛在0.1M磷酸盐缓冲液和2％多聚甲醛的0.1M磷酸盐或二甲胂酸盐缓冲液的混合物中固定过夜,然后用环氧树脂包埋。将环氧树脂混合的样品装入胶囊中，使其在38℃下聚合12小时，在60℃下聚合48小时。将薄切片在超薄切片机上切片并收集在铜网格上。将适当的区域切成65nm的薄切片，并用饱和的4％乙酸铀酰和4％柠檬酸铅溶液染色，然后在透射电子显微镜上在80kV下检查。根据制造商的说明书，使用细胞外通量分析仪测量在XF24V7细胞培养微孔板中培养的内皮集落形成细胞周围的培养基中的氧消耗速率。简而言之，在测定培养基中平衡后进行测量氧消耗速率测量。Seahorse分析仪使用带有24个光学荧光O2传感器的盒式磁带，这些传感器嵌入无菌一次性盒中，每个孔一个。在每次速率测量之前，柱塞将每个孔中的测定培养基混合8分钟以允许部分O2压力达到平衡。为了测量速率，柱塞轻轻地下降到孔中以形成腔室。在4分钟内定期测量O2浓度，并且从浓度随时间变化的斜率获得O2消耗速率。测量速率后，柱塞上升，轻轻混合孔以平衡培养基。基线率测量4次。将一种或多种测试化学品预先加载到传感器盒的试剂输送室中，然后气动注入孔中以达到所需的最终工作浓度。混合2分钟后，测量暴露后测量氧消耗速率。4个基线速率和2-6个测试速率的平均值用于数据分析。
　　 如前所述进行线粒体膜电位测量。在去极化细胞中,具有指示电势探针，例如四甲基罗丹明甲酯消失线粒体的标签;因此，红色荧光作为线粒体膜电位的指示剂。用含有500nM四甲基罗丹明甲酯的无酚红培养基替换培养基。将板在磷酸盐缓冲盐水洗涤3次。使用荧光显微镜捕获荧光信号，并分析来自每组>100个细胞。为了使细胞内Ca2+浓度成像，将细胞用敏感性染料乙酰氧基甲酯加载。然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤以除去细胞外。使用荧光显微镜捕获荧光信号。荧光强度反映。使用软件分析来自每组100个细胞的图像。为了评估线粒体酶的活性，如前所述进行测量线粒体脱氢酶活性的。简言之，将2.5毫克/在不含酚红的培养基的溶液加入到细胞中，并在37℃下温育2小时。然后，吸出MTT溶液，加入异丙醇以溶解甲cry颞浅动脉ls晶体，并将细胞在37℃下温育1小时。在处测量吸光度。进行至少独立实验，数据表示为正常内皮集落形成细胞的百分比。为了检测细胞内活性氧水平，研究人员使用二氯二氢荧光素二乙酸酯。将约细胞与在37℃在黑暗中温育，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞两次。使用软件，用流式细胞仪检测荧光。
　　 为了研究烟雾病内皮集落形成细胞中功能受损的机制，研究人员关注线粒体，因为先前的研究表明线粒体功能障碍导致细胞功能的改变并最终导致细胞死亡。使用电子显微镜分析，在烟雾病内皮集落形成细胞中观察到大量线粒体裂变和嵴损失，但在正常内皮集落形成细胞中未观察到。与电子显微镜数据一致，烟雾病内皮集落形成细胞中的线粒体比正常内皮集落形成细胞中的线粒体更短和更圆形。这些数据表明，与正常内皮集落形成细胞相比，烟雾病内皮集落形成细胞显示出改变的线粒体形态。研究人员确定烟雾病内皮集落形成细胞是否表现出线粒体功能障碍以及线粒体形态的改变。为了研究正常和烟雾病内皮集落形成细胞中线粒体功能的任何改变，研究人员首先通过测量测量氧消耗速率来评估正常和烟雾病内皮集落形成细胞中的细胞呼吸。为了测量三磷酸腺苷的产生，在注射解偶联剂羰基氰化物间氯苯基腙之前将寡霉素注入培养孔中。烟雾病内皮集落形成细胞持续显示减少的基础测量氧消耗速率，与三磷酸腺苷生成相结合的测量氧消耗速率，即寡霉素敏感的测量氧消耗速率，以及总氧化能力，即氯苯基腙敏感的测量氧消耗速率。相对于正常内皮集落形成细胞，烟雾病内皮集落形成细胞的基础呼吸率，三磷酸腺苷水平和氧化能力分别降低了约70％，80％和75％。抗霉素不敏感的测量氧消耗速率，被解释为非线粒体呼吸，在烟雾病内皮集落形成细胞中略微但没有显着降低。接下来，研究人员通过使用四甲基罗丹明甲酯测定显示烟雾病内皮集落形成细胞中的线粒体膜电位显着减弱。众所周知，线粒体是维持细胞Ca2+止血的重要Ca2+缓冲细胞器，并且积累诱导细胞死亡。由于烟雾病内皮集落形成细胞s表现出线粒体功能障碍，研究人员使用Fluo-4检测分析了内皮集落形成细胞s中的水平。研究人员发现烟雾病内皮集落形成细胞s的水平有所提高。此外，进行MTT测定以研究内皮集落形成细胞中线粒体酶的活性。研究人员发现烟雾病内皮集落形成细胞s显示出显着降低的线粒体还原酶活性。总体而言，这些数据表明，与正常内皮集落形成细胞相比，烟雾病内皮集落形成细胞表现出线粒体功能障碍。
　　 用NAC处理烟雾病内皮集落形成细胞以确定活性氧清除剂是否可逆转观察到的线粒体异常。令人惊讶的是，NAC处理的烟雾病内皮集落形成细胞在其长度和形状方面显示出健康的线粒体。当用NAC处理24小时后在内皮集落形成细胞中分析测量氧消耗速率时，研究人员发现NAC处理显着恢复了烟雾病内皮集落形成细胞中的基础呼吸速率，三磷酸腺苷水平和氧化能力。使用四甲基罗丹明甲酯测定，研究人员显示线粒体膜电位也在NAC处理的烟雾病内皮集落形成细胞中恢复。此外，测定显示NAC处理的烟雾病内皮集落形成细胞维持正常。这些数据表明，增加的活性氧水平对烟雾病内皮集落形成细胞中的线粒体产生有害影响，并且用活性氧清除剂处理可以逆转烟雾病内皮集落形成细胞中的线粒体功能障碍。
　　 目前的研究表明,烟雾病患者的内皮集落形成细胞s线粒体表现出形态学和功能异常。来自烟雾病患者的内皮集落形成细胞中线粒体的形态被空泡和破坏的嵴碎裂,而正常内皮集落形成细胞中的线粒体似乎是细长的和丝状的。在功能上,来自烟雾病患者的内皮集落形成细胞中的线粒体表现出降低的基础呼吸,三磷酸腺苷产生和总氧化能力，这表明来自烟雾病患者的内皮集落形成细胞在功能上有缺陷。此外，来自烟雾病患者的内皮集落形成细胞中的线粒体更加去极化并且表现出增加的活性氧和水平和线粒体还原酶活性降低。值得注意的是，仅降低活性氧水平的清除剂不仅逆转了线粒体的形态和功能异常，而且还恢复了内皮集落形成细胞的血管生成活性。因此，线粒体可能在烟雾病的发病机理中具有重要作用。
　　 线粒体参与能量产生以及其他细胞活动，例如信号级联，细胞增殖，衰老和细胞死亡。因此，细胞功能障碍是高度线粒体状态和活动异常有关。实际上，在许多疾病，包括神经变性疾病，代谢疾病，甚至被称为“线粒体疾病”或癌症的线粒体功能障碍的结果“线粒体疾病。”
　　 大量研究表明，线粒体损伤和功能障碍在各种心血管疾病中起重要作用,如动脉粥样硬化，高血压，中风，心力衰竭和缺血性心脏病。然而，到目前为止，还没有关于线粒体和烟雾病之间相关性的报道。研究人员的研究表明烟雾病患者的内皮集落形成细胞功能受损可能是线粒体异常引起的,这表明烟雾病可能是线粒体相关疾病。然而，为了证明这一假设，应该鉴定编码线粒体组分或线粒体DNA突变的核DNA突变。此类调查正在进行中。需要对导致烟雾病患者中内皮集落形成细胞的线粒体异常的各种因素进行额外的研究。这些研究可以清楚地将烟雾病中的线粒体异常识别为主要现象，而不是次要结果。
　　 越来越多的证据表明，循环的内皮集落形成细胞在内皮稳态中起着非常重要的作用。例如，有充分证据表明循环内皮集落形成细胞有助于持续的内皮修复。此外，内皮集落形成细胞功能障碍在烟雾病的发病中起重要作用。尽管仍有争议的结果，并且内皮集落形成细胞的确切作用尚未最终定义，但许多研究表明内皮集落形成细胞与烟雾病之间存在密切联系。
　　 在之前的研究中，研究人员不仅证明烟雾病患者的内皮集落形成细胞较少，而且内皮集落形成细胞s也显示出分化受损，功能障碍和衰老倾向。目前的研究表明，这些受损的功能和内皮集落形成细胞s在烟雾病患者的衰老可能是由于线粒体异常。这些异常可能与烟雾病患者受损血管的延迟修复和血管闭塞的发展有关。
　　 根据研究人员在这项研究中的数据，线粒体功能障碍可能是烟雾病患者内皮集落形成细胞缺陷的重要致病风险因素。该结果暗示烟雾病可能是线粒体相关疾病。此外，研究人员的研究表明活性氧与内皮集落形成细胞s的功能密切相关。该发现提供了烟雾病的病理机制和治疗靶标的线索，例如活性氧敏感的转录因子。最近，一项研究表明通过调节内源性活性氧与缺血性中风的脑缺血再灌注损伤密切相关。研究人员假设活性氧起着烟雾病的发病机制中起重要作用，而且研究人员有一个正在进行的研究这个问题。
　　 研究人员的研究有一些局限性。首先,样本量相对较小。研究人员的研究结果应该在更大的队列中得到验证。此外，研究人员无法招募年龄匹配的控件。然而，从健康的儿科志愿者获取血液在道德上是不合需要的，因为儿童是医学研究领域中的弱势受试者。最后，考虑到获得烟雾病患者的“病理”组织的实际困难，使用内皮集落形成细胞进行研究。
　　 研究人员的研究揭示了烟雾病患者内皮集落形成细胞s中线粒体的形态和功能异常。这一发现表明，烟雾病可能与线粒体有关。关于线粒体的其他研究可以为烟雾病的发病机制提供新的见解。