去泛素化酶泛素特异性蛋白酶在多种细胞途径中起重要作用，包括信号传导，剪接和先天免疫。在编码泛素特异性蛋白酶及其旁系同源物泛素特异性蛋白酶的的转录过程中发生外显子的进化保守跳跃，产生每种基因的两种主要同种型。泛素特异性蛋白酶的外显子编码位于区域内接头中的富含丝氨酸的氨基酸残基段，其连接末端推定的调节区和末端酶区。先前的发现表明，接头区域的变化导致两种去泛素化酶的同种型之间的功能差异，但迄今为止还没有公布关于这种功能差异的直接证据。研究人员发现泛素特异性蛋白酶的长同种型主要识别和去泛素化，与烟雾病发病有关的大型泛素连接酶。该观察结果代表了第一个实验证据，即保守的外显子跳跃改变了这类去泛素化酶的底物特异性。此外，研究人员发现泛素特异性蛋白酶的短和长同种型的相互作用组仅部分重叠。因此，泛素特异性蛋白酶是多细胞过程中的关键基因，通过进化保守的外显子跳跃产生两种功能不同的同种型。
　　 蛋白质单和多泛素化调节多种细胞现象，包括细胞质中的选择性蛋白质降解。这些反应的反向，去泛素化，涉及遍在蛋白底物和遍在蛋白-遍在蛋白键的切割。催化该过程和平衡的泛素信号传导的酶在体内被统称deubiquitylating酶。所有已知的DUB都是半胱氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，并且目前根据其催化中心的结构分为五个亚组。泛素特异性蛋白酶，其构成已知的的最大子群，是木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶和通过由两个共有元件的二元催化中心的特征在于被称为他和盒。
　　 超过已知人类中的三个，构成一个更密切相关的亚组。这些卖点具有涉及多种细胞现象，包括信号传导，剪接，和先天免疫独立的，但部分重叠的底物特异性的。在小鼠中，单次敲除泛素特异性蛋白酶或泛素特异性蛋白酶不会干扰活力和正常发育，而双敲除会导致胚胎致死，这表明这些蛋白质具有多余的功能。在结构上，除二元催化中心外，这三个共享一个特征域组织，由中存在的域，两个遍在蛋白样基序和锌指结构域组成。这三个卖点的末端区域包括一个锌指结构域，该蛋白样基序之一，以及直接催化反应二进制芯，而末端区域包括一个，另一蛋白样基序，这也是不可缺少的。末端区域可能有助于调节去泛素化和/或底物识别。另外，连接末端区域的连接区在去泛素化起作用，但末端和连接区的精确分子作用仍然是难以捉摸的。
　　 泛素特异性蛋白酶和各自具有两个进化上保守的替换的同种型，其中生物功能已被假定为不同的。外显子的跳跃替代所导致泛素特异性蛋白酶的短同种型和的表达，其具有端和区域之间更短的接头区，但保留媲美的长同种型的活动。泛素特异性蛋白酶的两种同种型在相同的实验条件下具有明显不同的亚细胞分布，尽管这种差异的潜在机制仍然未知。先前关于外显子跳跃机制的研究鉴定了一种特定元件，其导致在泛素特异性蛋白酶的成熟过程中产生两种替代同种型。然而，该元件在泛素特异性蛋白酶中不保守，即使泛素特异性蛋白酶经历类似的外显子的替代跳跃，表明在进化过程中泛素特异性蛋白酶获得了跳过外显子的独立机制.泛素特异性蛋白酶和的两种同种型均表达于在哺乳动物中类似的水平，这表明外显子跳跃的适中速率，同时泛素特异性蛋白酶的两种同种型的比率在骨佩吉特氏病特异性改变，表明该比例具有病理相关性。总之，这些研究结果表明，这类USP的同种型具有生理学上不同的功能;然而，迄今为止，任何此类功能差异的性质仍然未知。
　　 研究人员在探索新蛋白质的生物学相关性的过程中发现了泛素特异性蛋白酶同种型的功能偏倚。在以前的工作中，研究人员分离了一个涉及隐源性脑血管疾病烟雾病的关键基因，其中脑动脉有限区域的进行性狭窄和闭塞最终导致缺血性中风，脑梗塞和脆弱的侧支毛细血管的发展。尽管烟雾病的发病机制尚不清楚，但一些患者有家族史的事实表明遗传因素在发病机制中起重要作用。研究人员发现，功能未知的新基因中罕见的错义单核苷酸多态性使烟雾病的风险增加了多倍。研究人员克隆这种基因以及mysterin把它命名为。该神秘蛋白基因编码大的细胞内蛋白质，其具有由两个活性酶模块和环状泛素连接酶结构域组成的独特结构域组织。抑制mysterin表达导致斑马鱼异常血管生成和肌细胞生成，表明疾病相关单核苷酸多态性干扰在血管生成中的生理作用，导致烟雾病。为了进一步阐明mysterin的细胞功能，研究人员使用液相色谱-串联质谱搜索底物和/或辅因子，最终鉴定泛素特异性蛋白酶。在这里，研究人员报告了泛素特异性蛋白酶底物偏好中同种型特异性偏倚的第一个例子。对泛素特异性蛋白酶和之间关联的生化评估显示，mysterin主要被泛素特异性蛋白酶的长同种型所识别。此外，泛素特异性蛋白酶长同种型有效去泛素化神经元并保持其基础表达水平，表明替代外显子跳跃偏向泛素特异性蛋白酶的去泛素化底物偏好。此外，研究人员对泛素特异性蛋白酶结合蛋白进行了广泛的分析，并鉴定了多种同种型特异性结合蛋白，表明泛素特异性蛋白酶的两种同种型在不同的蛋白质组网络中发挥作用，并且在体内具有重叠但独立的细胞活性。
　　 为了阐明烟雾病相关蛋白质mysterin的细胞功能，研究人员寻求鉴定神秘蛋白结合蛋白，推断这些蛋白质将包括辅因子和/或神经元的底物。为此，研究人员在人胚胎肾细胞的末端瞬时过表达了含有FLAG标签的。研究人员使用抗抗体从细胞裂解物中沉淀出，并在没有分离过程如的情况下对总共沉淀物进行分析。除了本身外，还有四个阳性命中，包括受体异构体，在四项试验中可重复鉴定。在一项复制研究中，研究人员在细胞中瞬时表达了每个候选组织的神经元结合蛋白，使用特异性抗体进行免疫沉淀，然后对mysterin进行免疫印迹。在这项分析中，泛素特异性蛋白酶和可检测地与物理相关，而另外两种蛋白质则不是。然而，在核仁功能的因子，而被主要分布在胞质溶胶中。因此，尽管研究人员不排除或其他两种蛋白质与神经元功能相关的可能性，尽管它们在正常条件下结合和/或亚细胞分布不一致，但研究人员在本研究的其余部分重点关注泛素特异性蛋白酶。值得注意的是，在免疫印迹分析中经常将检测为多个条带。甚至使用相同的mysterin蛋白样品的独立免疫印迹试验有时会导致不同的外观，因此，研究人员认为它不是由生物条件的任何差异引起的，而是可能由极大的分子大小的神经元和蛋白质电泳中的微小程序效应引起的。
　　 研究人员通过逆转录聚合酶链反应从HEK293细胞获得编码泛素特异性蛋白酶的两种同种型的。令研究人员惊讶的是，具有较长接头区域的泛素特异性蛋白酶的同种型对具有较短接头的其他同种型具有显着更强的对神秘蛋白的亲和力。在泛素特异性蛋白酶中观察到在接头区域中类似的替代跳跃，并且泛素特异性蛋白酶的两种同种型具有不同的亚细胞分布。当研究人员检查泛素特异性蛋白酶同种型的亚细胞分布时，研究人员发现两种同种型通常都位于细胞质中，同时还有神秘蛋白，而少数细胞也在细胞核中显示泛素特异性蛋白酶的微弱信号。因此，泛素特异性蛋白酶与神经肽的结合比泛素特异性蛋白酶更强，并且这种作用主要不是亚细胞分布中同种型特异性差异的结果。
　　 研究人员假设泛素特异性蛋白酶的替代外显子跳跃偏向于其底物偏好。为了测试这个想法，研究人员研究了泛素特异性蛋白酶是否具有异构体特异性偏爱神经元作为去泛素化底物。为此目的，泛素特异性蛋白酶的长和短同种型在细胞中单独共表达，同时在其末端含有三个串联FLAG标签的。使用亲和珠沉淀，并通过使用抗遍在蛋白抗体的免疫印迹检查其泛素化状态。泛素特异性蛋白酶的过表达显着降低了与相关的多聚泛蛋白链信号，而泛素特异性蛋白酶的过表达则没有，表明泛素特异性蛋白酶具有更强的针对myterin的去泛素化活性。这里检测到的多聚泛蛋白信号是由于泛素化的神经元蛋白本身，而不是潜在的共免疫沉淀蛋白，因为即使在通过与一起孵育潜在的非共价蛋白相互作用解离后也能检测到类似的多泛素化。泛素特异性蛋白酶的酶促必需盒和锌指结构域的突变消除了其对于的去泛素化活性，但不影响泛素特异性蛋白酶和mysterin之间的关联，支持泛素特异性蛋白酶通过其内在的酶活性使其底物神秘蛋白去泛素化的观点。此外，泛素特异性蛋白酶L突变体增加了神秘蛋白相关多聚泛蛋白的水平，表明，至少在细胞中，这种突变体对内源性去神素化作用具有显着的负面影响。总之，研究人员的数据表明，mysterin是泛素特异性蛋白酶的底物，并且外显子的保守跳跃显着降低了其对的特异性亲和力。
　　以前的研究表明，泛素特异性蛋白酶去除连接的多泛素链，从而保护其免受连接的多泛素化触发蛋白酶体的蛋白质降解的基材。研究人员调查了泛素特异性蛋白酶对于mysterin的去泛素化是否也是如此。免疫沉淀，然后用连接的多聚泛蛋白进行免疫印迹，发现神秘蛋白确实被连接的多聚泛蛋白修饰，其被野生型泛素特异性蛋白酶除去，但在表达酶促突变体的细胞中积累。另外两项观察结果支持了研究人员的预测，即mysterin的去泛素化与多泛素化诱导的蛋白酶体降解呈负相关。首先，蛋白酶体抑制剂处理导致神经元的多泛素化物种的积累，而该物种在泛素特异性蛋白酶的过表达时消失。其次，泛素特异性蛋白酶的酶促突变体使HEK293T细胞中的神经元蛋白不稳定，可能是通过突变体对细胞中内源性活性的显性负效应来增加神经元的多泛素化，而泛素特异性蛋白酶的突变体没有影响的稳定性。因此，泛素特异性蛋白酶优先从神经毒素中除去连接多聚泛蛋白并维持其在细胞中的基础表达水平。
　　 接头区域的替代变异如何偏向泛素特异性蛋白酶对于myterin的亲和力？尽管泛素特异性蛋白酶的底物结合结构域尚未明确鉴定，但一个简单的模型是连接子区域直接介导神经元结合。研究人员使用泛素特异性蛋白酶的五个截短突变体，在神秘蛋白结合过程中评估了泛素特异性蛋白酶中结构区和结构域的作用，包括长接头区。每个变体在其末端含有三个串联标签，在细胞中瞬时过表达。使用FLAG亲和珠沉淀每种泛素特异性蛋白酶变体，并通过用抗抗体的免疫印迹检测共沉淀的内源性。结果显示末端区域对于结合是必需的。然而，具有长接头区域的截短突变体，未能与神经元结合，表明长接头是必需但不足以与神经元的物理结合。结构域和区也是必需的但不足以结合。这些结果与DUSP结构域和末端区域共同敲除mysterin的模型一致，并且该协同性由接头区域以同种型特异性方式协调。
　　 为了进一步表征泛素特异性蛋白酶的两种主要同种型的功能差异，研究人员基于每种相互作用组将包括对每种同种型特异的底物和/或辅因子的预期对每种同种型进行了相互作用组分析。研究人员在细胞中瞬时过表达泛素特异性蛋白酶的长和短同种型，末端标记有三个串联FLAG表位;使用抗抗体从细胞裂解物中沉淀它们;并且在没有分离的情况下对总共沉淀物进行分析。在所有四个试验中可重复获得的阳性命中以维恩图形式显示在中。以蓝色和红色显示的蛋白质是先前通过相互作用组分析鉴定的底物和/或辅因子或在先前的研究中通过实验评估，分别。虽然在免疫印迹分析中检测到神秘蛋白与泛素特异性蛋白酶的短同种型的微弱物理相互作用，但分析仅在长相互作用组中发现了这可能是由于差异在两个实验程序的检测限或灵敏度之间。研究人员不区分这些相互作用组中的底物和辅因子。然而，相互作用组模式之间的部分重叠表明泛素特异性蛋白酶的两种进化上保守的同种型之间的功能多样性不限于神经元的去泛素化。
　　泛素特异性蛋白酶中外显子的替代跳跃导致在泛素特异性蛋白酶的区域间接头中缺失由氨基酸组成的短元件，其显着降低了泛素特异性蛋白酶对神经元的亲和力和去泛素化活性。以往的研究表明，即使泛素特异性蛋白酶及其旁系同源物泛素特异性蛋白酶的短同种型保留活动，表明外显子跳跃不消除这些卖点的酶活性。相反，外显子跳跃更可能调节这类的底物特异性。研究人员的分析显示，泛素特异性蛋白酶的两种同种型的相互作用组模式部分地重叠，但不完全重叠，即，一些潜在的底物优选地通过的短或长同种型识别。泛素特异性蛋白酶的接头区域中的外显子编码的短元件是必需的但不足以与神经元的物理结合。同样，DUSP结构域和末端区域也是必需的，但还不够。区怀有负责活性酶芯，所以簇推测识别泛素mysterin的泛素部分。以前结构的研究表明，泛素特异性蛋白酶的域暴露在其分子表面上的多个疏水补丁，被预测通过疏水性相互作用来介导蛋白质-蛋白质相互作用。事实上，泛素特异性蛋白酶具体地说经由DUSP域结合和从两个和其结合配偶体，组蛋白H2B除去泛素。结构域可以以类似方式识别神经毒素的骨架多肽。然而，可能以不同的方式被泛素特异性蛋白酶识别。研究人员的相互作用组分析证明SART3被两种同种型识别，而只有长同种型才显示出与的显着结合。此外，泛素特异性蛋白酶的DUSP结构域足以结合虽然有必要，但不足以使结构域可以与神经毒素结合的强度低于对的结合，从而产生对末端酶促区域与遍在蛋白部分的支持性结合的要求。在这种情况下，区域间连接体可以参与调节区域的协同识别。为了进一步探索这一想法，有必要确定泛素特异性蛋白酶的整体结构和进一步的生化评估。
　　 最近报道，结构域通过通过域间相互作用从泛素特异性蛋白酶的酶核中释放水解的游离遍在蛋白来促进去泛素化循环。然而，对于来说，对这种活性的要求并不那么重要，正如那些作者所讨论的那样，单个DUSP结构域可能在去泛素化反应循环期间连续处理底物识别和遍在蛋白释放。在自然选择下可能已经保持了接头区域的变异。系统发育研究表明起源于单个祖先的USP，在脊椎动物出现之后，在真菌和后生动物之间保守。尽管祖先保留了外显子，但缺乏它，并且组成性地仅产生短同种型。实验评估鉴定了泛素特异性蛋白酶外显子的末端区域中的保守核苷酸元件，其特异性地导致剪接不充分，导致产生两种替代同种型。这种机制至少在哺乳动物中是保守的。主动产生的泛素特异性蛋白酶的短和长同种型显示出明显不同的亚细胞分布，支持该区域不仅仅是区域间连接位点的假设。连接区域的功能相关性可能与他们丰富的丝氨酸的组合物，其中包括多个潜在的磷酸化位点。丝氨酸激酶的特异性调节可能在整个区域发生，尽管目前没有证据支持这一观点。最近的研究，包括研究人员的研究表明，区域间连接的变异是这类USP的关键功能决定因素，尽管分子机制仍有待阐明。