烟雾病是一种缓慢的，进行性的闭塞性疾病，发生在脑内颈动脉的末端部分。然而，烟雾病中内皮细胞的功能和特征是未知的。研究人员使用诱导的多能干细胞衍生的颅内分析了这些特征。多能干细胞系由携带变体环指蛋白的烟雾病患者的外周血建立，并且健康人用作对照。在多能干细胞的内皮分化后，使用细胞分选仪将细胞纯化为颅内。研究人员分析了它们的增殖，血管生成和对一些血管生成因子的反应。还使用微阵列和蛋白质组学分析颅内以进行全面的基因和蛋白质表达分析。无论是否存在任何血管生成因子，烟雾病中的血管生成都显着受损。相反，对照和烟雾病衍生细胞之间内皮增殖不显着。关于微阵列，途径分析说明细胞外基质受体相关基因，包括整联蛋白，在烟雾病中显着下调。蛋白质组学分析显示细胞骨架相关蛋白被下调，并且剪接调节相关蛋白在烟雾病中被上调。细胞外基质受体相关基因的下调可能与源自烟雾病患者的多能干细胞的颅内中的血管生成活性受损有关。剪接调节相关蛋白的上调暗示对照和烟雾病颅内之间的剪接模式的差异。
　　 烟雾病是在脑内颈动脉的末端部分中出现的缓慢，进行性狭窄闭塞性疾病。异常血管网络随后在大脑底部形成，作为抵抗血液供应减少的侧支循环。组织病理学研究显示烟雾病患者颈内颅外末端内膜增厚，内弹性椎板波动和内侧变薄显着几种致病机制，包括炎症，各种血管生成因子上调，和内皮祖细胞的异常，已假设。结果显示，内皮祖细胞在烟雾病患者中的血管生成活性受损，这表明内皮祖细胞的表型可能是一种疾病特异性的体外模型。然而，他们难以使用内皮祖细胞进行生殖和综合研究，因为原代细胞的增殖活性有限。首先报道了人类多能干细胞的建立，目前，诱导多能干细胞被认为可用于研究特定遗传背景下的疾病机制以及推进再生医学。最近，环指蛋白通过全基因组连锁和关联研究被鉴定为东亚人烟雾病的易感基因。环指蛋白的突变发现在家族性烟雾病患者，非家族性烟雾病患者和对照组中。在这些发现之后，关注突变体环指蛋白的生物学效应的研究取得了进展。
　　首先建立了携带来自皮肤成纤维细胞的环指蛋白烟雾病特异性多能干细胞，并将这些细胞系分化为内皮细胞。他们报道这些细胞的特征是血管生成受损，并得出结论，诱导多能干细胞衍生的颅内可被视为作为烟雾病的体外模型，因为这些颅内具有与从烟雾病患者获得的那些内皮祖细胞相似的表型。在本研究中，研究人员从携带环指蛋白的烟雾病患者的外周血单核细胞建立了多能干细胞系，并将这些细胞系分化为颅内。为了阐明烟雾病发病机制的新方面，研究人员通过在多能干细胞产生的颅内中进行全面的基因和蛋白质表达分析来研究细胞功能，例如增殖和血管生成。烟雾病特异性多能干细胞来自三名患有家族性烟雾病的无关患者。患有烟雾病的受试者的性别和年龄如下：烟雾病男性;烟雾病女性;和烟雾病的女性。招募三名正常受试者作为对照。他们的诊断基于日本烟雾病研究委员会的标准。患者和正常受试者通过书面知情同意书招募，该同意书得到了北海道大学医院和熊本大学的机构审查委员会的批准。人体样本的所有实验程序均经伦理委员会，“北海道大学医院伦理委员会”，“熊本大学生命科学学院流行病学和综合研究伦理委员会”，“人类基因组伦理委员会和基因分析”批准熊本大学生命科学学院“和熊本大学临床研究与先进医疗技术伦理委员会”研究“。所有动物实验在获得熊本大学动物实验伦理委员会的批准后在熊本大学进行。
　　 通过用颅外梯度离心分离，然后将它们在培养基中在抗抗体包被的培养皿上活化和扩增。如前所述，多能干细胞由活化的产生。简而言之，用携带计算机断层扫描仙台病毒感染，感染复数为仙台病毒为如前所述制备。培养几天后，将感染的细胞以接种在丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞上培养皿中的细胞。第二天，用细胞培养基替换培养基。感染后多天，选择菌落并在含有培养基的纤维细胞上扩增。作为有一些修改先前的描述进行内皮分化。使用由胶原酶，胰蛋白酶，和组成的计算机断层扫描溶液分离亚汇合的多能干细胞，并以一定比例接种到涂有的培养皿上，骨形态发生蛋白和碱性成纤维细胞生长因子处理多能干细胞;血管内皮生长因子，使用缀合的抗抗体纯化颅内细胞，和缀合的抗抗体。在含有的培养基中，在处理的纤维细胞上维持多能干细胞，所述补充有血清替代物，谷氨酰胺青霉素和链霉素和碱性成纤维细胞生长因子。使用培养基，补充青霉素和链霉素，以及将颅内维持在胶原蛋白包被的培养皿上。胎牛血清。使用根据制造商的说明分析细胞增殖。在实验之前，亚汇合时的颅内是血清和生长因子饥饿过夜。将细胞以接种孔板中每孔的细胞。附着后，用染料处理细胞，孵育几小时。为了估计增殖细胞数，使用酶标仪在波长下测定吸光度。为了分析群体倍增时间，将颅内与补充有胎牛血清的培养基一起培养，并在细胞附着后对细胞进行计数。使用。使用下式计算群体倍增时间：倍增时间持续时间，其中是计数和初始铺板时的细胞数。
　　亚汇合时的颅内是血清和生长因子-一夜之间饥饿。然后将颅内分离，悬浮在没有血清或血管生成因子的中，并以细胞/孔的密度接种到涂有的孔板上。然后将这些细胞与或不与指定的生长因子一起温育。培养多小时后，使用几倍物镜通过倒置显微镜捕获管形成数字图像。为了定量，通过工具程序自动测量总管长度。从颅内中提取总。总样品反转录，扩增，并使用基因芯片标记的。将样品与阵列杂交。对于扫描，使用颅内。使用颅内确定表达值。将原始数据导入软件。使用以下步骤进行无监督聚类：排除没有基因符号的探针;选择具有超过表达水平的标准偏差的探针，并且排除在超过四个样品中具有微小表达水平和小于零的信号强度的探针。使用计算机断层扫描根据制造商的说明分离全细胞提取物。使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶通过电泳分离蛋白质提取物，并使用转移至硝酸纤维素膜。电印迹后，将膜在室温下在牛血清白蛋白中封闭多分钟，并在中用一抗探测过夜。第一抗体的稀释比如下：兔抗整联蛋白和抗微管蛋白。将膜在室温下在中与辣根过氧化物酶缀合的二抗孵育几小时。根据制造商的方案使用增强的化学发光检测系统检测免疫反应条带。
　　用裂解缓冲液从颅内中提取总蛋白质。使用分离提取的蛋白质用于第一维，并且在丙烯酰胺梯度凝胶中用于第二维的，随后用蛋白凝胶染色染色。用颅内扫描染色的凝胶，并使用进行分析。为了使每个凝胶中的斑点体积值标准化，将每个斑点的原始量除以包含在相同凝胶中的所有斑点的总体积。斑点显着差异表达，差异超过几倍并从凝胶中切下。通过离子搜索评估切除的蛋白质的胰蛋白酶消化物以鉴定来自肽序列数据库的蛋白质。当基于使用搜索引擎的评分，匹配得分在时是显着的，接受蛋白质鉴定。对于染色，在第几天用解离分化的细胞。将解离的细胞收集到含有胎牛血清的锥形管中，并计数细胞数。离心细胞并弃去上清液。将缀合的抗人抗体和缀合的抗人抗体以细胞的浓度添加到细胞悬浮液中。与抗体一起温育多分钟后，用胎牛血清洗涤细胞两次并重悬浮。将细胞沉淀的浓度调节至用胎牛血清。通过以流速事件/秒分析和分选细胞。抗体在激发并在收集。抗体在激发并在收集。将细胞在中漂洗并在多聚甲醛中固定几分钟。用含有封闭后，在下在封闭溶液中加入一抗过夜。然后将细胞在中洗涤三次，并在室温下与封闭溶液中的二抗一起温育几小时。所有实验程序均符合熊本大学动物实验伦理委员会的动物使用指南。通过计算机断层扫描溶液收集烟雾病-多能干细胞并将其睾丸内注射到小鼠中。小鼠购自。动物接受极少的处理并且在乙醚麻醉下进行操作。将小鼠圈养在有线的透明有机玻璃笼中，随意获取食物和水。灯光周期是标准的开始照明。每天监测动物并评估健康和状况。在畸胎瘤变得可触知后，通过颈椎脱位使小鼠安乐死。收集肿瘤样品，在多聚甲醛中固定，并进行组织学分析。
　　 三名病人有共同的突变环指蛋白，和对照组没有的突变环指蛋白。在所有细胞系中，注意到多能标志物的表达和染色的阳性发现。巢式分析表明烟雾病-多能干细胞系对基因组是阴性的。核型分析显示烟雾病-多能干细胞系具有正常的核型。研究人员通过畸胎瘤形成证实了烟雾病-多能干细胞分化成三个胚层。在多小时计算的多能干细胞衍生的平均群体倍增时间在对照群体，在烟雾病群体中，这些之间没有显着差异。暴露于血管生成因子多小时不影响增殖。相反，体外血管生成测定证明，来源于携带突变的烟雾病患者的颅内在存在或不存在血管生成因子的情况下显示出显着减少的总管长度。微阵列表达数据在补充材料中提供。微阵列分析证明，无监督的层次聚类的步骤清楚地提取了探针和区别对照细胞的烟雾病细胞。使用火山图，研究人员发现在烟雾病-多能干细胞中，探针下调不到几倍，基因上调超过几倍。这些下调基因的通路分析表明，烟雾病-多能干细胞衍生中细胞外基质受体相关基因的富集得分显着高于对照细胞。在上调基因列表中，卵母细胞减数分裂相关基因，如有丝分裂停滞缺陷，苯并咪唑同源物，钙调蛋白样不受抑制的出芽，在烟雾病多能干细胞衍生中显着富集。此外，黄体酮介导的卵母细胞成熟相关基因，如苯并咪唑同源物并且丝裂素活化蛋白激酶也显着富集。
　　 在蛋白质组学分析中，在每个凝胶中检测到近蛋白质斑点。凝胶分析显示烟雾病和对照细胞之间蛋白质点差异表达至少几倍。详细地说，在烟雾病颅内中有几个蛋白质点表达增加，点表达减少。在烟雾病-多能干细胞衍生中，细胞角蛋白，嘌呤核苷磷酸化酶和谷胱甘肽转移酶的表达显着降低。由于存在蛋白质同种型，在三个位点检测到。相反，异质核核糖核蛋白，增殖细胞核抗原，小核辅助因子，含有亚基的伴侣蛋白，结合基序蛋白的表达在烟雾病颅内中，核糖体蛋白显着增加。由于蛋白质同种型的存在，在两个位点被检测到。在这项研究中，研究人员首次报道了烟雾病患者外周血单核细胞的多能干细胞系的产生及其内皮分化，与使用烟雾病患者的成纤维细胞相反。研究人员观察到血管生成活性显着即使没有血管生成因子，烟雾病颅内也会减少。然而，增殖活性没有显着差异。研究人员还发现使用微阵列，在烟雾病颅内中四种细胞外基质受体相关基因显着下调。其中，研究人员专注于，后者也在蛋白质水平下调。此外，蛋白质组学分析表明，烟雾病-多能干细胞衍生中细胞骨架相关蛋白的表达减少，蛋白的表达增加。已知培养的颅内的管形成由细胞外基质凝胶诱导并且由血管生成因子增强。因此，受损的管形成表明对的响应在烟雾病颅内中下调。代表性细胞外基质受体相关蛋白之一，在颅内中大量表达，并且它有助于血管生成因此，下调可能与烟雾病颅内中受损的管形成有关。此外，烟雾病颅内中细胞外基质受体相关基因的下调可能与细胞骨架相关蛋白的下调有关，因为细胞外基质受体可通过酶调节细胞骨架。
　　 在本研究中，没有血管生成因子增加颅内中的血管生成。之前的研究报道了烟雾病患者平滑肌细胞中某些血管生成因子的异常反应。有趣的是，据报道，烟雾病患者的标本中各种血管生成因子如均被上调。包括血清，脑脊髓液，并从患者烟雾病血管壁组织中。笔者认为受损的血管生成活性将上调的一些血管生成因子的释放，但负反馈机制未充分工作烟雾病患者因血管生成因子反应异常。从磁共振前体的剪接一些调节剂，如核蛋白蛋白质，在烟雾病-多能干细胞衍生被上调的蛋白组学分析发现即这些蛋白质在调节选择性剪接中起重要作用，并且已知选择性剪接对于增加蛋白质组多样性是重要的。有人提出，细胞类型特异性剪接模式对于每种细胞类型特有的功能和特征是必不可少的，并且已知正常剪接模式的破坏会引起许多疾病。此外，过去的研究报道了过度表达这些蛋白质改变靶基因的剪接模式。烟雾病颅内中剪接调节因子的上调可能诱导影响烟雾病患者内皮功能的改变的剪接模式。未来对烟雾病特异性颅内中全局剪接模式的研究可能会澄清烟雾病发病机制的这一新方面。研究人员的研究存在一些局限性。研究人员没有研究异常环指蛋白与差异表达的基因或蛋白质之间的关系。此外，研究人员没有研究这些差异表达的基因或蛋白质如何导致烟雾病颅内中受损的管形成。
　　 即使在发现环指蛋白作为烟雾病的易感基因后，对烟雾病的发病机制知之甚少。由于该突变的外显率低，环境因素被认为对促进烟雾病的发病机制很重要。提出了一个双击假说，其中除了环指蛋白的突变外，一些触发因素如血液动力学应激，缺血，感染或免疫紊乱对于开始疾病病理过程的第一步至关重要。尽管研究人员展示了在本研究中，烟雾病内皮细胞在普通培养条件下的性质，未来对烟雾病在剪切力或低氧条件下细胞功能的分析可以阐明导致烟雾病发展的机制。总之，研究人员的研究证明了烟雾病-多能干细胞衍生中细胞外基质相关基因的下调和剪接调节蛋白的上调。需要进一步的研究来阐明这些差异表达的基因和蛋白质在烟雾病发展中的病理作用。